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脑损伤释放靶向成骨祖细胞的细胞外囊泡促进骨愈合

文章题目：Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors

摘要
临床证据表明，同时发生创伤性脑损伤（TBI）会加速骨愈合，但其潜在机制尚不清楚。本研究表明，TBI后受损的神经元，主要是海马中的神经元，释放富含成骨微RNA（miRNA）的细胞外小囊泡（sEVs），这些囊泡靶向骨中的成骨前体细胞以刺激骨形成。我们发现，在TBI后富集于sEVs中的miR-328a-3p和miR-150-5p通过分别直接靶向FOXO4或CBL的3'UTR，促进成骨作用，并且携带miR-328a-3p的sEVs的水凝胶能够有效修复大鼠的骨缺陷。重要的是，sEVs表面纤连蛋白表达增加，有助于TBI sEVs靶向骨中的成骨前体细胞，从而暗示对sEVs表面纤连蛋白的修饰可用于骨靶向药物递送。总之，我们的工作揭示了中枢对骨形成的调节作用，并明确了受损神经元与成骨前体细胞之间的联系，无论是在动物还是在临床环境中。

引言
大脑调节着身体的大多数生理功能，从复杂的认知、学习和记忆，到基础体温、心率和呼吸的调节。大脑作为周围组织稳态的主调节器已被广泛认可；骨重塑的中枢调节代表了一个新兴且不断扩展的研究领域 [1,2]。多种神经源性因子，如瘦素、血清素、半乳凝素、神经肽Y、促黑皮质素和安非他命调节转录物等，已被证明能够作用于下丘脑并深刻改变骨重建过程 [1-5]。最近的研究表明，通过成骨细胞分泌的分子骨钙素（OCN），使得骨骼也可能对大脑产生影响 [6,7]。骨骼对中枢神经系统的发育和认知功能产生影响，表明骨骼和大脑之间存在紧密的双向交流。

创伤性脑损伤（TBI）是最严重的创伤诱发损伤之一，也是致死和致残的主要原因之一 [8]。在伴有长骨骨折的患者中，创伤情况下常常观察到合并TBI。有趣的是，过去五十年的临床证据表明，伴随TBI可加速骨愈合 [9,10]。多项研究表明，伴随TBI的患者和大鼠具有更强的骨痂形成能力和更高的矿物质密度。有报道指出，在TBI期间，一些成骨细胞因子和激素，如神经生长因子、血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白、凝血酶和瘦素在血清或大脑中升高 [9,11-14]；然而，关于受损大脑和骨形成加剧之间的相关性缺乏有力证据。一些研究表明，免疫因子可能参与其中；然而，观察到对其他器官的损伤（这些器官也会导致免疫因子变化）并不促进骨折愈合，这仍是一个谜。因此，阐明TBI刺激成骨作用的机制不仅将为神经对骨的控制提供有力证据，也将推动潜在疗法用于治疗骨愈合延迟或骨不愈合。

在本研究中，我们发现TBI患者和大鼠的血浆小细胞外囊泡（sEVs）比可溶性因子更具有促进成骨的潜力。受损的神经元产生携带成骨微RNA（miRNAs）的sEVs，这些sEVs靶向成骨前体细胞。含有这些miRNAs的sEVs的水凝胶有效加速了骨愈合，并修复了大鼠的颅骨缺损。我们的研究结果在动物和临床环境中建立了受损大脑和骨形成之间的明确联系。

结果
TBI加速了患者和大鼠的骨愈合
为了确认TBI对骨折愈合的影响，我们比较了12例伴有股骨骨折及TBI的患者与12例仅有股骨骨折的患者的恢复速度（补充表1）。手术后4周和6周的X线图像显示，骨折合并TBI患者的骨折恢复速度明显快于仅有骨折的患者（图1a和补充图1）。骨痂体积是骨折愈合的重要指标，骨折合并TBI患者在骨折后的4周和6周时，其骨痂体积显著大于仅有骨折的患者（图1a）。这些数据证实了TBI促进了患者的骨折愈合。

为了在动物模型中模拟受损大脑对骨形成的影响，我们使用侧向液体冲击法在大鼠中建立了TBI模型（图1b和补充图2）。随后将30只Sprague–Dawley（SD）大鼠随机分配到近端胫骨缺损（PTD）组和PTD合并TBI（PTD + TBI）组。微计算机断层扫描（micro-CT）分析显示，与PTD大鼠相比，PTD + TBI大鼠在术后第7天和第14天的骨痂体积显著增加（图1c）。骨体积/组织体积（BV/TV%）、苏木精和伊红（H&E）染色以及每单位骨周长的成骨细胞数量也显示PTD + TBI大鼠的成骨作用显著增加（图1d, e和补充图3a）。因此，体内骨再生率在TBI后显著增加（补充图3b-d）。此外，OCN染色证实PTD + TBI大鼠的成骨增加（图1f, g），而两组之间骨表面酒石酸抗性酸性磷酸酶（TRAP）阳性细胞和破骨细胞表面数量没有显著变化（补充图3e-g）。相反，肝损伤不能在PTD或PTD合并肝损伤大鼠模型中促进骨愈合（补充图4）。总之，这些结果表明TBI而非肝损伤刺激了患者和大鼠的骨形成并加速了骨愈合。

TBI患者和大鼠的血浆sEVs促进了TBI刺激的成骨作用
为了探讨TBI促进骨形成的机制，我们首先比较了TBI患者或大鼠与对照组的血浆成骨效应。我们发现TBI患者或大鼠的血浆促进了成骨细胞分化（图2a, b和补充图5a），但对其增殖无影响（补充图5b）。

接下来，我们将TBI血浆分为不可溶和可溶组分，以筛选出导致TBI刺激成骨的因素。出乎意料的是，TBI患者和大鼠的血浆sEVs在体外促进成骨的能力显著高于可溶性因子（图2c, d）。根据国际细胞外囊泡学会的建议，通过透射电子显微镜（TEM）、NanoSight分析和蛋白质标志物（CD9、Alix和TSG101）免疫印迹验证了纯化的sEVs（补充图6）。值得注意的是，TBI大鼠血浆中的sEVs浓度明显高于假手术组（图2e）。

为了确认sEVs在体内TBI刺激的成骨作用和骨愈合中的作用，将sEVs分泌抑制剂GW4869静脉注射到合并TBI的PTD大鼠中。通过NanoSight分析和蛋白质免疫印迹确认了GW4869处理的大鼠血浆中sEVs的显著减少（补充图7a, b）。微CT分析显示，GW4869处理后在受伤第7天和第14天的骨痂体积、骨体积/组织体积（BV/TV%）和小梁数量（Tb.N）显著减少（P < 0.05）（图2f-h）。通过GW4869抑制sEVs的释放后，小梁骨和OCN表达也显著降低（图2i-k）。这些结果表明，sEVs的释放对于TBI刺激的成骨作用和大鼠骨愈合是必需的。

综上所述，这些结果表明，TBI患者和大鼠的血浆sEVs比可溶性因子具有更大的促进成骨的潜力。sEVs在体外的TBI刺激的骨形成和大鼠骨愈合中发挥了重要作用。

TBI患者和大鼠释放的血浆sEVs携带强效的成骨miRNAs，如miR-328a-3p和miR-150-5p
接下来，我们进行了miRNA测序和蛋白质组分析，以探讨TBI来源的sEVs如何促进成骨和骨愈合。富含于sEVs中的miRNAs是健康和疾病中骨重塑的关键调节因子 [15,16]。因此，我们通过miRNA测序评估了假手术组（sham-sEV）和TBI组（TBI-sEV）中的miRNA表达谱。为了鉴定特异性参与的miRNAs，我们比较了TBI和假手术大鼠血浆sEVs的miRNA谱，结果通过热图显示（图3a和补充表2）。我们通过实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）验证了四个显著上调的miRNAs和两个下调的miRNAs（图3b）。

为了确定这些miRNAs对成骨细胞形成的影响，我们将miRNA模拟物或阴性对照转染入MC3T3-E1细胞和大鼠原代BMSCs中。我们发现miR-328a-3p和miR-150-5p显著促进了成骨细胞的分化（图3c, d）。相反，miR-328a-3p或miR-150-5p的抑制剂则阻止了成骨前体细胞的成骨分化（图3e, f）。有趣的是，与健康对照相比，TBI患者的血浆sEVs中miR-328a-3p和miR-150-5p也显著增加（图3g）。

这些数据表明，TBI患者和大鼠释放的sEVs携带强效的成骨miRNAs，如miR-328a-3p和miR-150-5p。

sEV miR-328a-3p和miR-150-5p通过直接靶向FOXO4和CBL的3′-UTR来促进成骨
为了识别miR-328a-3p和miR-150-5p的靶点，我们首先使用PicTar和TargetScan搜索潜在的miRNA靶点。基于3' UTR中的miRNA位点的表达，预测超过100个mRNAs可能受到这些miRNAs的调控。在这些候选基因中，有八个基因参与抑制成骨作用。

为了确定miRNAs是否直接靶向这些基因，我们将潜在靶点的3'UTR克隆到双荧光素酶报告系统中。使用MC3T3-E1细胞的报告实验表明，miR-328a-3p显著抑制了FOXO4的3′UTR，miR-150-5p显著抑制了CBL的3′UTR（图4a-c）。这些两个3'UTR中潜在的miRNA位点的突变消除了其对miRNA的反应（图4c-e）。

我们接下来确定了TBI-PTD大鼠骨缺损部位靶基因的表达水平是否与miRNAs有关。我们发现，与PTD大鼠相比，FOXO4和CBL在TBI-PTD大鼠骨缺损部位的水平显著降低，这表明FOXO4和CBL可能参与了TBI刺激的骨形成（图4f, g）。相应地，转染miR-328a-3p或miR-150-5p模拟物显著降低了MC3T3-E1细胞中内源性FOXO4或CBL蛋白的水平。而相反地，抑制miR-328a-3p或miR-150-5p则显著增加了FOXO4或CBL的蛋白水平（图4h, i）。我们进一步发现，敲低FOXO4或CBL产生了类似于miR-328a-3p或miR-150-5p过表达的成骨变化（图4j, k）。重要的是，miR-328a-3p或miR-150-5p的成骨效应可以通过FOXO4或CBL的过表达部分被救回，表明FOXO4和CBL是miR-328a-3p和miR-150-5p的下游靶点，促进了骨形成。

总之，这些结果表明，sEV miR-328a-3p和miR-150-5p通过直接靶向FOXO4和CBL的3′UTR分别下调了FOXO4和CBL的表达，从而促进了骨形成。

受损的神经元产生靶向骨骼和成骨前体细胞的sEVs
接下来我们探讨这些成骨sEVs在TBI期间的来源。我们推测这些sEVs可能来自受损的大脑组织。原位杂交显示，TBI后大鼠脑组织中miR-328a-3p的表达显著增加，特别是在海马的CA1和DG区域（图5a和补充图8）。重要的是，免疫荧光染色显示TBI显著诱导了大鼠大脑中CD63（外泌体和小细胞外囊泡的标记物）的表达（图5b）。有趣的是，大多数CD63表达于微管相关蛋白2（MAP2）阳性的细胞（MAP2是神经元的标记物，尤其是神经元胞体和树突的标记物），特别是在海马的CA1区域，而不是星形胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性的细胞，这表明受损的神经元细胞而非星形胶质细胞大量分泌sEVs（图5b, c和补充图9, 10）。

原发性创伤性损伤通常会引发一系列继发性损伤机制，如水肿、出血和脑血流减少，导致脑组织的缺血性损伤 [17]。尽管缺血性损伤是TBI的继发性后果，缺血在破坏动脉脑血流的情况下是主要的损伤机制，导致大脑组织缺乏氧气和葡萄糖，氧-葡萄糖剥夺（OGD）是TBI常用的体外模型 [18,19]。RUNX2和ALP染色的蛋白质印迹结果显示，OGD处理后的原代海马神经元共培养大鼠BMSC和MC3T3-E1细胞后，其成骨分化增加（补充图11d, e）。此外，我们发现，OGD处理后培养的原代海马神经元中sEVs的释放以及sEV miR-328a-3p和miR-150-5p水平显著升高（图5d和补充图11b, c）。而OGD处理后小胶质细胞系BV2的sEVs中，miR-328a-3p含量无显著变化，而miR-150-5p的含量增加（补充图11a）。

为了确定这些受损神经元产生的sEVs及其miRNA货物是否能够靶向骨骼和成骨前体细胞，将TBI或假手术大鼠血浆中分离出的PKH67标记的sEVs（每只大鼠800 µg）静脉注射给大鼠，并通过颅内注射（ICV）或静脉注射后进行生物光学成像评估PKH67-sEV的分布。我们发现，从TBI大鼠中纯化的PKH67标记的sEVs（而非肝损伤或假手术大鼠）在骨中积累，但不在内脏器官或大脑中（图5e和补充图12、13c）。此外，我们比较了PKH67标记的sEVs在培养的BMSC、MC3T3-E1和MLO-Y4细胞（成骨细胞系）中的摄取情况，发现BMSC和MC3T3-E1细胞系吸收TBI大鼠血浆sEVs的量明显多于假手术大鼠，而在MLO-Y4细胞中则没有差异（图5f）。值得注意的是，大鼠PTD部位miR-328a-3p的原位杂交分析显示，TBI大鼠在术后7天时PTD部位的miR-328a-3p丰度高于假手术大鼠（图5g）。综上所述，这些数据暗示来自受损神经元的sEVs及其miRNA货物能够靶向骨骼和成骨前体细胞。

Fibronectin 1 (FN1) 将sEVs靶向至成骨前体细胞和骨组织

研究发现，TBI诱导的sEVs会在骨组织中聚集。我们推测这些sEV表面或膜上表达的蛋白质可能有助于这些sEV对骨组织的亲和力。因此，我们进行了蛋白质组学分析，比较了TBI大鼠和假手术大鼠血浆sEV的蛋白质谱（图6a和补充数据1）。发现FN1（一种细胞外基质和表面糖蛋白）的量在TBI sEVs中相比对照sEVs增加了1.32倍。值得注意的是，A2M（一种神经损伤的标记物）在TBI sEVs中也增加了3.099倍，这表明这些sEVs可能来自受损的神经元。进一步的实验结果证实了TBI大鼠sEVs中FN1和A2M蛋白的增加（图6b, c和补充图14a, b）。此外，蛋白质印迹结果显示，从TBI大鼠血浆中分离的sEVs中MAP2和UCHL1（两种神经元标记物）也有所增加（补充图14a）。免疫荧光染色显示，TBI显著诱导了大鼠大脑中FN1和A2M的表达（图6d, e）。此外，在PTD-TBI大鼠的PTD部位可以清晰地观察到A2M和OCN的共染，而在单纯PTD大鼠中则没有观察到（图6f），这表明sEV的摄取可能同时增加了PTD-TBI大鼠的成骨作用。

我们进一步在体外证实了FN1引导的sEV对成骨前体细胞的靶向作用。正如预期的那样，与对照组相比，OGD处理的原代海马神经元、HT22细胞系及其sEVs中FN1的表达显著增强（图6g-i和补充图14c-g）。此外，BMSC和MC3T3-E1细胞摄取OGD处理后的原代海马神经元和HT22细胞分离出的sEV的量明显多于对照组（图6j和补充图14g）。重要的是，这些效果被一种合成肽GRGDNP（Gly-Arg-Gly-Asp-Asn-Pro）完全逆转，这种肽抑制了纤连蛋白与整合素的结合（图6k）。此外，FN1抑制肽还抑制了TBI sEVs在骨中的积累（图6l）。综上所述，这些结果表明，FN1指导了sEV对成骨前体细胞和骨组织的靶向作用。

含有miR-328a-3p的水凝胶有效促进骨形成并修复骨缺损

为了确定损伤大脑释放的成骨sEV和miRNAs在促进骨愈合中的治疗潜力，将miR-328a-3p/对照模拟物电转移到sEV中并嵌入水凝胶中。为了将miR-328a-3p/对照模拟物负载到sEV中，将100 µg纯化的sEV与纳米颗粒miRNA复合物（miR-328a-3p/对照模拟物的最终浓度为100 nM）在4°C的100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中轻轻混合。以200 V进行电穿孔5毫秒后，在37°C孵育30分钟。我们发现，含有miR-328a-3p的水凝胶有效地促进了体外成骨细胞的分化和矿化，这通过水凝胶嵌入的MC3T3-E1 3D模型中ALP和茜素红染色的显著增加得到证实（图7a-d）。

然后将含有sEV miR-328a-3p的水凝胶应用于大鼠PTD模型，术后第7天和第14天检测骨愈合。结果表明，sEV miR-328a-3p增加了BV/TV%、Tb.N、OCN和FOXO4蛋白水平（图7e-g和补充图15b-e）。含有sEV miR-328a-3p水凝胶的PTD在术后14天被新形成的骨替代，其速度远快于对照组（图7e, h）。TRAP阳性细胞（破骨细胞）和骨表面破骨细胞的数量在各组间未观察到显著变化（补充图15f-h）。这些结果表明，sEV miR-328a-3p有效促进了大鼠的骨愈合。

为了确定含有sEV miR-328a-3p的水凝胶对修复颅骨缺损（一种最具挑战性的骨科问题）是否有效，生成了一个关键大小的大鼠颅骨缺损模型并使用水凝胶进行处理。水凝胶中sEV的释放动力学如补充图16a所示。微CT分析显示，与对照组相比，术后1个月（补充图16b）和3个月（图7i），嵌有sEV-miR-328a-3p的水凝胶处理的大鼠残余缺损的尺寸明显更小，BV/TV%和Tb.N显著增加（图7j, k和补充图16c, d）。HE染色显示，术后3个月水凝胶几乎完全修复了颅骨缺损（图7l）。

综上所述，这些发现表明，含有sEV miR-328a-3p的水凝胶在修复骨缺损方面具有强大的潜力，不需要任何额外的外源因素或细胞的参与。

讨论

虽然在临床医学中早已知晓TBI可以加速骨愈合，但其潜在机制仍基本未知。本研究表明，TBI后受损的神经元，尤其是海马中的神经元，释放了富含成骨miRNAs的小细胞外囊泡（sEVs），这些sEVs通过循环系统传递至骨组织，靶向成骨前体细胞以促进成骨和加速骨愈合，提示了在骨稳态过程中存在一种从大脑到骨的相互作用。我们发现TBI后血浆sEV中富含的miR-328a-3p和miR-150-5p是强有力的成骨miRNAs，含有miR-328a-3p的水凝胶在修复骨和治疗延迟愈合和骨不连接方面具有巨大潜力。此外，我们发现sEVs表面FN1的增加有助于将TBI sEVs靶向至骨组织。因此，修改sEVs表面的FN1可能用于骨靶向药物递送，为骨靶向治疗提供了途径。总之，我们的研究结果在动物和临床环境中建立了受损大脑与骨形成之间的明确联系（图8）。

临床上对骨折的管理旨在实现骨愈合，以在尽可能短的时间内达到最佳的功能恢复。然而，大约10%的情况下，骨折愈合可能出现延迟或不愈合的情况，这对患者的生活质量产生显著影响。目前尚无批准的药物用于治疗已确立的骨不连接，或加速骨折愈合。因此，更好地理解骨折愈合的分子机制并寻求能够有效加速骨再生的创新策略对于治疗延迟骨愈合或骨不连接至关重要。

骨折愈合是一个复杂的过程，涉及许多种类的细胞和因子。我们使用了单侧骨皮质缺损模型来研究骨修复，这种模型已被许多先前的研究使用过。尽管这种修复模型再现了骨折愈合的多数步骤，但大多数临床骨折是通过次级骨形成（软骨内骨化）来愈合的。因此，未来应使用稳定的骨折模型进行进一步研究，以验证其潜在应用。本研究确定了富含成骨miRNA的小细胞外囊泡（sEVs），这些sEVs强烈加速了骨愈合，代表了一种治疗延迟骨愈合或骨不连接的潜在策略。

骨稳态依赖于细胞间活性分子的转移，关于sEVs在通过特定sEV miRNA和蛋白质传递来调节骨重建的证据日益增加。sEVs及其携带的miRNA是骨折修复过程中的关键组成部分，这一过程才刚刚开始被理解。在骨折愈合过程中，BMSC衍生的sEVs有助于小鼠模型中的骨重建。然而，sEVs在骨稳态中的调节活动网络及其在骨损伤中的治疗潜力仍然在很大程度上未知。此外，已发表的报告表明，sEVs主要在成骨细胞、破骨细胞和骨细胞及其前体之间交换；但由远端细胞（如神经元）释放的sEVs在这一过程中的作用尚不清楚。在本研究中，我们证明了由受损神经元分泌的miR-328a-3p和miR-150-5p在血浆sEVs中，通过靶向成骨前体细胞，促进了成骨和骨修复。有趣的是，以往研究发现，患者骨折后的血清miR-328-3p水平显著增加，且在TBI患者的血清和脑脊液样本中也检测到上调的miR-328-3p水平，这支持了我们关于miR-328a-3p作为与骨折和TBI相关的成骨miRNA的发现。

FOXO4在哺乳动物组织中广泛表达，包括骨。去除成骨前体细胞中的FOXO4会导致高骨量，这归因于成骨细胞数量和骨形成的增加。FOXO4的抗成骨作用是由于FOXO4与β-连环蛋白结合，并阻止β-连环蛋白与TCF/Lef转录因子之间的结合，从而抑制了Wnt/β-连环蛋白的转录活性。最新研究表明，E3泛素连接酶CBL蛋白通过对受体酪氨酸激酶及其他分子的泛素化和降解，调节成骨前体细胞的增殖、分化和存活。我们的研究发现FOXO4和CBL分别是miR-328a-3p和miR-150-5p的直接和功能靶基因，强调了这些miRNAs在骨形成中的关键作用。总的来说，这些发现令人信服，因为循环miRNAs不仅是生物标志物，还是受损大脑与远端骨愈合过程之间复杂跨系统通信的功能组成部分。

先前的研究发现，细胞外基质蛋白纤连蛋白（FN）在sEV靶向中起着重要作用。FN的一个独特特性是它能够与大量的细胞粘附受体、成长因子和细胞外基质蛋白结合。肝内皮细胞释放的含有SK1的sEV通过FN-整合素依赖的粘附与肝星状细胞结合。由人类癌细胞释放的微囊泡可以以FN为依赖方式被成纤维细胞摄取。然而，这些研究均在体外进行，因此sEVs与FN最终会在体内到达哪个组织或器官尚不清楚。

在本研究中，我们发现，TBI后，循环中的sEVs及其所携带的miRNAs优先被转运到骨组织。此外，TBI后sEVs表面的FN1含量增加，这有助于它们的成骨功能。因此，这些sEVs可用于骨靶向药物递送，为骨靶向治疗提供了一条新途径。